科研 Water Research：功能微生物的相互作用及其对甲烷生物转化为短链脂肪酸的贡献

　　本研究解释了基于甲烷的膜生物膜反应器中电子受体投加速率对短链脂肪酸生产的影响，并揭示了功能微生物间的相互作用以及对甲烷生物转化为短链脂肪酸的贡献。

　　甲烷生物转化为高附加值液体化学品已被认为是扩大石油主导化学品市场的一个有前景的解决方案。近年来有研究报道各种电子受体可以驱动生物甲烷转化为短链脂肪酸（short-chain fatty acids SCFAs）。然而，关于供应电子受体速率对由甲烷产生的液体化学产物的影响知之甚少。本研究在高低速条件下向三个独立的膜生物膜反应器（membrane biofilm reactors MBfRs）中分别加入硝酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐和亚硝酸盐的复合物以研究电子受体的投加速率对甲烷生物转化为短链脂肪酸的影响及其微生物特性。长期实验表明所有测试电子受体在高供应速率条件下有利于甲烷生物转化为短链脂肪酸。而在低供应速率条件下，短链脂肪酸的产率降低。微生物群落特征表明生物膜主要由甲烷八叠球菌（Methanosarcina）、甲烷杆菌（Methanobacterium）、 丙酸菌（Propionispora）和梭状芽孢杆菌（Clostridium）组成。根据这些微生物的已知代谢途径，推测这些产甲烷菌和发酵剂共同促进了甲烷生物转化为短链脂肪酸。该研究结果有助于理解电子受体在甲烷生物转化为液体化学物种过程中的作用。

　　不可再生原油储量的过度开采引起全世界对开发化工生产替代原料的研究。甲烷是天然气的主要成分，因其易于获得碳氢化合物，且可低成本大规模获取，甲烷可作为生产高附加值化学品的原料。传统技术将甲烷转化为合成气，然后通过Fischer-Tropsch 途径转化为液体化学物质最终实现甲烷的利用。然而在昂贵催化剂存在条件下，对高温和高压的要求通常会导致操作成本增加，使得该技术在小型、分散和浪费的甲烷源上不具有经济可行性。

　　微生物甲烷氧化是可以产生各种有价值产品（短链和长链脂肪酸甲酸和聚合物）的一个很有前途的过程。已有研究证明好氧甲烷氧化菌可以通过激活酶pMMO/sMMO的强C-H键将甲烷转化为有价值的产物。到目前为止，虽然已经提出了各种策略（如添加生物补充剂和营养物质并改变氮浓度）来促进其工业潜力，但由于在活化C-H键过程中由于电子向氧气的损失以及碳向二氧化碳的损失使得好氧甲烷氧化菌将甲烷生物转化为液体化学物质的常规过程中能量和碳效率相对较低。

　　与好氧甲烷氧化相比，厌氧甲烷氧化可以克服与氧相关的碳和能量效率障碍，是一种可行的甲烷生物转化方法。从热力学角度看，没有电子受体甲烷厌氧氧化是不可行的。因此，当前的研究主要集中在评价强化过程中不同的电子受体。例如，有学者研究了代谢工程产甲烷菌甲烷八叠球菌（

　　）上各种电子受体Fe (III)、硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐和Mn (IV))对甲烷和二氧化碳转化的影响，其中用10mMFe (III)获得的i算生产率为0.62g/L/d。除纯培养物外，富含硝酸盐的厌氧甲烷氧化古菌

　　的混合培养基通过完全逆向的甲烷生成途径将甲烷转化为乙酸盐。然而，当硝酸盐或亚硝酸盐以限速条件作为电子受体投加时，醋酸盐的产率仅为38.4 mg L

　　，其值太低不能满足经济上可行的要求。近年来，在膜生物膜反应器中人们进一步探索了硝酸盐、亚硝酸盐和氧在甲烷转化为短链脂肪酸中的个体作用。结果表明，所有电子受体均有利于生物膜中醋酸盐的生成（醋酸盐的产生速率为1.1-114.6 mg d

　　）。先前的研究还强调在膜生物膜中利用氧限制条件将甲烷转化为短链脂肪酸的可能更加灵活。此外，观察到醋酸盐产率的变化是由于将不同电子受体投加到反应器中形成完全不同的微生物群落。尽管这些已经研究了不同电子受体对甲烷生物转化为液体化学物质的影响，但对电子受体的投加速率是否在这个过程中起作用还不清楚。

　　本研究旨在研究电子受体的投加速率对甲烷生物转化为液体化学物质的影响。具体来说，首先通过三种不同的膜生物膜反应器评价了硝酸盐、亚硝酸盐以及硝酸盐和亚硝酸盐的复合物对短链脂肪酸（醋酸盐、并酸盐、丁酸盐、戊酸盐和己酸盐）产量的影响。然后通过16SrRNA高通量测序对不同电子受体和不同投加速率的膜生物膜反应器中的微生物群落进行了研究。此外，还对甲烷生物转化为短链脂肪酸的潜在官能团进行了表征和讨论。研究结果对进一步发展以甲烷为基础的生物技术，提高化工产品附加值具有一定的指导意义。

　　建立了三种工作容积为50ml的实验室规模的膜生物膜反应器以研究在不同电子受体投加速率下甲烷生物转化为短链脂肪酸。膜生物膜反应器的原理示意图如图1所示，简而言之，反应器管内有一束符合无泡状中空纤维膜。由64根纤维膜组成的膜束表面积为2.41×10

　　。所有纤维的一端连接到气瓶，另一端用胶水密封。用气压调节器将中空纤维内部的甲烷压力控制在1.25大气压下进行扩散。将100 ml液体容积为25 mL的溢流瓶与反应器链接用于再循环、气体和液体采样以及PH检测。

　　用从依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化母体生物反应器中提取的25 mL污泥接种膜生物膜反应器，反应器主要由硝化还原菌（

　　接种后，膜生物膜反应器随后以12 h为周期的分批模式运行，每个周期包括投加和倒液、反应和沉淀阶段。在每个周期的投加阶段，将25 mL无机新鲜培养基加入到膜生物膜反应器中，使水力停留时间为24 h。然后将膜生物膜中的大量液体通过蠕动泵以12.5mLmin

　　的速率进行再循环。每个膜生物膜反应器在室温条件下进行628天，将其分为两个阶段。第一阶段，分别以400mgNL

　　的速率将硝酸盐、亚硝酸盐以及它们的复合物投加到膜生物膜反应器中。第二阶段，电子受体分别以较低的速率投入，分别为80mgNL

　　。根据电子受体的供应速率，我们将第一阶段和第二阶段分为高投入速率和低投入速率。每天通过手动加入1molL

　　O. 0.5mL/L酸性微量元素溶液和0.2mL/L碱性微量元素溶液。新鲜培养基经氮气脱气30分钟后进入厌氧反应器，保持厌氧状态。

　　在三个生物反应器运行过程中，每周用2.5mL注射器从膜生物膜反应器中收集进水和出水样品三次，然后用一次性微孔过滤器过滤进行化学分析。用LachatQuickChem8000流动注射分析仪测定硝酸盐和亚硝酸盐浓度。配备有Bio-RadHPLC色谱柱和RID 检测器的高效液相色谱仪用于确定短链脂肪酸的组成和浓度。已有的文献已对Agilent7890A测定溶解甲烷浓度和实验操作进行详细描述。pH计测定反应堆的pH,根据COD（化学需要量）平衡计算了三种不同投加电子速率的甲烷转化效率。

　　在每个阶段的稳定阶段收集三个膜生物膜反应器的样品以确定反应器中微生物群落及其对短链脂肪酸的贡献。按照制造商说明指南使用FastDNASPIN土壤试剂盒从生物膜样品中提取总基因组DNA.通过NanoDrop分光光度定量DNA浓度。16SrRNA基因测序过程及数据处理过程如下：使用通用引物926F/1392R 对古菌和细菌的V6-V8区域进行扩增，然后在澳大利亚生态基因组中心的IlluminaMiSeq平台进行测序。在过滤掉短而低质量的读长后，QIIMEv1.8.0对具有97%相似性操作分类单元进行聚类。通过将具有代表性的OTU序列与Greengenes 数据库对比得到一个OTU表进行分类。原始的16SrRNA测序数据可以在NCBISequenceReadArchive (SRA) 数据库中获得。

　　天的初始培养后，生物膜在中空纤维表面逐渐生长，同时三个生物膜反应器均在测试的条件下完成了短链脂肪酸的生产。如图

　　天中发生故障，主要是由于膜生物膜反应器的再循环管发生了泄露。问题解决后，短链脂肪酸的生产速率逐渐恢复，在第

　　。有趣的是，亚硝酸盐的消耗没有受到这次事故的影响，并且出水亚硝酸盐总是低于检测的极限。估计

　　图2 R1-R3中总短链脂肪酸、乙酸和丙酸的生产速率（a: R1; b: R2; andc:R3）。

　　）。同时，三个膜生物膜反应器中供应的电子受体被消耗，出水样品中没有检测到硝酸盐和亚硝酸盐。三个膜生物膜反应器综合反映了短链脂肪酸的生产与电子受体的供应速率直接相关。因此，在第二阶段，

　　门为主。第一阶段电子受体以高速率投加时，属于变形杆菌的系统型在生物膜中占主导地位，而浮霉菌和

　　中富集。在第二阶段，变形菌在三种膜生物膜反应器中保持第一优势类型，但相对丰度较第一阶段明显增加。基于主成分分析方法（

　　在不同操作阶段个体微生物群落结构彼此之间更为相似。这些结果表明不同电子受体的投加对微生物群落的形成有更大的影响，而不是电子受体的投加速率。

　　图3 在R1-R3中异丁酸、丁酸、戊酸、异戊酸和己酸的生产速率（a: R1; b: R2; andc:R3）。

　　%，这两种细菌因其能将甲烷氧化与硝酸盐或亚硝酸盐还原反应耦合而闻名，但这两种细菌在生物膜中都无法检测到。生物膜中亚硝酸型甲烷厌氧氧化（

　　）微生物的缺乏表明它们可能不参与甲烷氧化或硝酸盐/亚硝酸盐还原反应。在三种膜生物膜反应器中均检测到产甲烷菌，而不是厌氧甲烷氧化菌。尤其是在

　　%。这些与甲烷相关的古菌丰度变化与短链脂肪酸的生产性能相一致，表明这些微生物可能参与了激活甲烷氧化的过程有利于短链脂肪酸的生成。

　　微生物参与的甲烷转化的关键步骤是甲烷活化与接受电子途径耦合。此前的研究得出当硝酸盐、亚硝酸盐或氧作为电子受体时，在膜生物膜反应器中实现甲烷生物转化为短链脂肪酸。然而，关于电子受体投加速率对生物转化为短链脂肪酸的影响还未得到系统的研究。本研究表明电子受体的投加速率可能会影响甲烷生物转化为短链脂肪酸的性能。短链脂肪酸的最高生产速率分别为

　　，这是第一阶段以高电子受体投加速率获得的。这些速率大大高于在第二阶段中低电子受体供应条件下获得的速率。这些结果共同表明甲烷生物转化为短链脂肪酸可以通过电子受体的投加速率来控制。从理论上讲，当有足够的甲烷供应时，应提供更多的电子受体来产生短链脂肪酸，这与我们的实验结果一致，即在较高的电子受体投加速率下获得较高的短链脂肪酸生产率。需要指出的是我们的研究仅提供了两种投加速率。甲烷生物转化为短链脂肪酸的适宜电子受体投加速率仍需优化和验证。

　　)可知二氧化碳是更有利的最终产物。然而，膜生物膜反应器中的反应可能发生在更复杂的条件下，这可能有利于短链脂肪酸作为甲烷氧化过程的终端产物，尽管甲烷生物转化为短链脂肪酸的△

　　较小。另外，膜生物膜反应器中的共营养微生物能够有效地分享每个部分反应的剩余能量，因此能够支撑能量较低的反应。

　　微生物或好氧甲烷氧化菌，表明短链脂肪酸的生产途径与之前的报道不同。在投加不同电子受体的膜生物膜反应器中检测到与甲烷有关的微生物是甲烷八叠球菌和甲烷杆菌，它们被称为产甲烷菌，能够通过

　　或有机化合物产生甲烷。然而，甲烷八叠球菌和甲烷杆菌也具有相反的产甲烷途径，在缺乏电子受体的情况下能够氧化痕量甲烷，这被称为痕量甲烷氧化。考虑绿到三个膜生物膜反应器中产甲烷菌与短链脂肪酸之间的正相关，推测产甲烷菌可能参与了促进甲烷氧化反应的过程。另一方面，鉴于

　　基因难以区分产甲烷菌和厌氧甲烷氧化。